如何“绕开抗体”实时检测植物内源蛋白？近日，350vip8888新葡的京集团陆钰明教授课题组在国际权威期刊Plant Communications在线发表了题为“Rapid and dynamic detection of endogenous proteins through in-locus tagging in rice”的研究论文。该研究将新型荧光素酶系统与基因敲入技术结合，在植物上建立了一种无需抗体、超快速、高通量地动态检测植物内源蛋白的新技术——TagBIT。

利用该团队前期开发的高效片段敲入技术（TR-HDR），TagBIT系统将只有11个氨基酸的新型蛋白标签HiBiT原位敲入至目标蛋白的N/C端（原位标签，In-locus tagging）；然后利用筛选得到新型荧光素底物“Fluorofurimazine”开发了适用于植物的荧光素酶反应体系。对10+个水稻内源蛋白进行的实时追踪实验表明，TagBIT可实现各种类型的蛋白研究，对内源蛋白实现：（1）超快速的Western blot（无需抗体）；（2）像GUS/GFP一样的原位发光成像；（3）像Luciferase一样的酶动力学动态追踪；（4）像Flag一样的高效的co-IP和质谱检测互作蛋白。值得注意的是，TagBIT技术通过原位标签，绕开了传统的基因克隆和载体构建限制，首次实现了对水稻超大基因TOR（~26k）的动态检测和蛋白互作研究。

研究团队首先设计了一个用于N端标记的通用的供体DNA序列，并选择了3个候选基因：MDH2、TT1和SLR1。在使用商业HiBiT蛋白检测试剂盒的初步试验中，他们遇到了信号强度低和稳定性有限等问题，这对于TT1和SLR1等大量中低丰度蛋白的检测构成了挑战。HiBiT系统由Promega公司开发并商业化应用，其检测灵敏度已经非常高，要在该基础上进一步提升检测效率非常困难。研究团队通过大量研究，另辟蹊径地筛选采用了一种新型荧光素底物——Fluorofurimazine；并根据植物组织的特点系统性优化了整个酶促反应体系。最终的检测结果表明，系列优化使该超高灵敏度检测系统又进一步大幅提升了近7倍。这一重大改进，使植物上大量的低丰度内源蛋白的检测成为可能。

利用TagBIT系统，研究团队首先发展了超快速的Western Blot体系。由于该技术无需抗体，可转膜后直接显影（无需反复洗涤和抗体孵育），极大地简化了整个免疫印迹过程。动态检测应用上，研究人员成功实现了对赤霉素信号通路中关键蛋白SLR1丰度的动态追踪。尽管赤霉素GA3刺激SLR1的mRNA水平上升，但TagBIT酶促分析显示蛋白水平在40分钟内急剧下降61.6%，揭示了mRNA与蛋白质丰度不一致的现象。这项技术为实时监测植物蛋白丰度提供了有效手段。

研究内源蛋白的时空分布对于理解其功能至关重要。传统的免疫化学染色技术依赖于特异性抗体进行空间检测，在植物中常常面临挑战；而基于转基因的（GFP标记）检测方法由于其异位效应，往往不能准确反应内源蛋白的真实时空分布。HiBiT标签因其发光特性，在哺乳动物研究中显示出用于原位蛋白可视化的潜力，但需要另一配体蛋白LgBiT，因此植物上尚无相关研究。为了解决这一问题，研究团队构建了表达LgBiT的转基因系（LgBiT-OE）并得到了稳定的T1代后代。为了测试这种方法，他们以水稻中具有根特异性表达的基因Lsi2为目标蛋白，构建了Lsi2-TagBIT原位标签株系。将其与LgBiT-OE杂交后，对F1代幼苗（Lsi2-TagBIT×LgBiT-OE）进行了原位生物发光检测。将F1代幼苗浸入Fluorofurimazine溶液中，并用冷冻CCD相机成像，揭示了Lsi2在根部的特定定位，证实了该方法的有效性。这种通用的杂交策略实现了植物蛋白的有效原位可视化，并为阐明植物内源蛋白分布提供了一种多功能工具。

研究团队进一步探究了TagBIT技术在检测植物内源蛋白-蛋白互作（PPIs）方面的应用潜力。尽管HiBiT和LgBiT具有出强烈的相互作用，但其实验表明单独的LgBiT并未能有效沉淀目标蛋白，这表明此类应用需要额外的相互作用强度。因此，他们采用抗HiBiT抗体进行co-IP实验，以检测内源TagBIT蛋白及其互作蛋白。他们选择了雷帕霉素靶蛋白（TOR）基因作为研究对象，该基因对于能量代谢、作物产量、抗病性和耐逆性至关重要，并且由于其庞大的基因长度（约26kb），研究起来颇具挑战。研究团队通过原位标签，成功获得TagBIT-TOR基因编辑植株。接着，在T3代幼苗上使用HiBiT抗体进行了co-IP实验。通过质谱分析共沉淀产物，揭示了772个潜在互作蛋白，证实了TagBIT系统的有效性。这项研究首次为水稻内源TOR的蛋白质相互作用网络提供了基础信息，表明TagBIT技术是阐明大型基因编码的内源蛋白之间互作的可行方法。

田益夫博士为本文第一作者，350vip8888新葡的京集团陆钰明教授和南方科技大学朱健康院士为通讯作者。该研究得到了科技部重点研发计划、国家自然科学基金和博新计划等项目资助。另外，该技术可以成为“水稻全基因组蛋白标签计划”的重要技术组成，有力推动“功能蛋白”研究。

“水稻全基因组蛋白标签计划（RPTP）”简介

2020年11月13日，上海交大陆钰明教授联合李家洋院士、 韩斌院士和美国科学院朱健康院士、 Pamela Ronald院士在Molecular Plant杂志在线发表了一篇题为“Rice Protein Tagging Project: A Call for International Collaborations on Genome Wide in-locus Tagging of Rice Proteins”的论文，提出了一项名为“水稻全基因组蛋白标签计划（RPTP）”的倡议，旨在通过国际合作，在全基因组范围内为水稻的每一个蛋白编码基因原位融合一个蛋白标签，该计划有望促进以蛋白质为基础的分子机理研究。